Zika vírus associado com microcefalia

Jernej Mlakar, MD, Misa Korva, Ph.D., Nataša Tul, MD, Ph.D., Mara Popović, MD, Ph.D., Mateja Poljšak-Prijatelj, Ph.D., Jerica Mraz, M.Sc. , Marko Kolenc, M.Sc., Katarina Resman Rus, M.Sc., Tina Vesnaver Vipotnik, MD, Vesna Fabjan Vodušek, MD, Alenka Vizjak, Ph.D., Jože Pižem, MD, Ph.D., Miroslav Petrovec , MD, Ph.D., e Tatjana Avšič Zupanc, Ph.D.

10 de fevereiro de 2016 DOI: 10,1056 / NEJMoa1600651

Abstrato
Artigo
Referências
Citando artigos (1): ZIKV, um flavivirus mosquito-borne emergente, foi inicialmente isolado a partir de um macaco rhesus na floresta Zika em Uganda em 1947. 1 É transmitida por várias espécies de mosquitos Aedes. Depois da primeira infecção ZIKV humana, casos esporádicos foram relatados no Sudeste Asiático e África sub-saariana. 2 ZIKV foi responsável pelo surto em Yap Ilha da Micronésia em 2007 e para grandes epidemias na Polinésia Francesa, Nova Caledônia, Ilhas Cook, e Ilha de Páscoa em 2013 e 2014. 3,4 em 2015, houve um aumento dramático nos relatos de infecção ZIKV nas Américas. O Brasil é o país mais afetado, com estimativas preliminares de 440.000 a 1,3 milhões de casos de infecção ZIKV autóctone relatados através de Dezembro de 2015. 5

O quadro clínico clássico de infecção ZIKV se assemelha ao de dengue e chikungunya e se manifesta por febre, dor de cabeça, artralgia, mialgia e exantema maculopapular, um complexo de sintomas que dificulta o diagnóstico diferencial. Embora a doença é auto-limitada, os casos de manifestações neurológicas e síndrome de Guillain-Barré foram descritos na Polinésia Francesa e no Brasil durante ZIKV epidemias. 5,6 Relatórios recentes do Ministério da Saúde do Brasil sugerem que os casos de microcefalia aumentaram um factor de aproximadamente 20 entre os recém-nascidos na região nordeste do país, o que indica uma possível associação entre a infecção ZIKV na gravidez e malformações fetais. 5

Nós apresentamos um caso de transmissão vertical do ZIKV em uma mulher que provavelmente foi infectado com ZIKV no nordeste do Brasil, no final do primeiro trimestre de gravidez. Nossa discussão inclui detalhes de imaging fetal e análises patológicas e virológicos.

RELATO DE CASO

Em meados de outubro de 2015, uma mulher europeia previamente saudável de 25 anos de idade veio para o Departamento de Perinatologia no Centro Médico da Universidade de Ljubljana, Eslovénia, por causa de anomalias fetais assumidos. Desde dezembro de 2013, ela viveu e trabalhou como voluntário em Natal, capital do Rio Grande do Norte. Ela ficou grávida no final de Fevereiro de 2015. Durante a 13ª semana de gestação, ela tornou-se doente, com febre alta, que foi seguido por osteomuscular severa e dor retro-ocular e um prurido, erupção maculopapular generalizada. Como não havia uma epidemia ZIKV na comunidade, foi suspeita de infecção com o vírus, mas nenhum teste de diagnóstico virológico foi realizada. A ultra-sonografia, que foi realizado em 14 e 20 semanas de gestação apresentaram crescimento fetal normal e anatomia.

O paciente retornou à Europa com 28 semanas de gestação. exame ultra-sonográfico que foi realizado com 29 semanas de gestação mostrou os primeiros sinais de anomalias fetais, e ela foi encaminhada ao Departamento de Perinatologia. Naquela época, ela também notou redução dos movimentos fetais. A ultra-sonografia que foi realizada a 32 semanas de gestação confirmada retardo de crescimento intra-uterino (estimado terceiro percentil de peso fetal), com líquido amniótico normal, uma placenta medindo 3,5 cm de espessura (tamanho normal) com inúmeras calcificações, um perímetro cefálico abaixo do segundo percentil para a gestação (microcefalia), ventriculomegalia moderada, e um diâmetro transcerebellar abaixo do segundo percentil. Estruturas cerebrais foram turva, e existem inúmeras calcificações em várias partes do cérebro ( Figura 1A e 1B FIGURA 1Pré-natal ultra-sonográficos Imagens e fotografias de coronais Fatias de cérebro.).Não houve outras alterações estruturais fetais óbvias. Fetal, e os fluxos sanguíneos uterinos umbilicais eram normais na eco-Doppler.

A apresentação clínica levantada suspeita de infecção viral fetal. Por causa de doença cerebral grave e microcefalia, o feto foi dado um prognóstico ruim para a saúde neonatal. A mãe pediu que a gravidez ser encerrado, eo procedimento foi posteriormente aprovado pelas comissões de ética nacionais e hospitalares. interrupção médica da gravidez foi realizada a 32 semanas de gestação. Na entrega, a única anomalia morfológica foi a microcefalia proeminente. consulta genética que incluía uma história detalhada família materna não revelaram qualquer suspeita de síndromes genéticas ou doenças. Uma autópsia foi realizada, como é obrigatório em todos os casos de interrupção da gravidez. A mãe desde consentimento informado por escrito para a publicação deste relato de caso.

MÉTODOS

Sistema Nervoso autópsia e Central (SNC) Exame

Uma autópsia do feto e da placenta foi realizada 3 dias após o término da gravidez, com uma extensa amostragem de todos os órgãos, placenta e do cordão umbilical. As amostras foram fixadas em formalina a 10% tamponada e embebidos em parafina. amostras de tecido fresco foram coletadas para as investigações microbiológicas. Cérebro e da medula espinhal foram fixados em 27% de formalina tamponada durante 3 semanas, após o que um exame neuropatológico foi realizada com uma vasta amostragem do cérebro e da medula espinhal. Secções de todas as amostras de tecido foram coradas com hematoxilina e eosina. A imunocoloração para proteína ácida fibrilar glial, neurofilamento, antigénio leucocitário humano DR (HLA-DR), CD3 (para destacar as células T), e CD20 (para destacar as células B) foi realizada em amostras representativas do SNC.

Microscopio eletronico

O tecido foi recolhido a partir de cérebro fixado em formalina e fixação foram submetidos em 1% de tetróxido de ósmio e a desidratação em concentrações crescentes de etanol. A amostra foi, em seguida, incorporado em Epon. secções de cortes semifinos (1,4 uM) foram feitas, corado com Azul II, e analisados por meio de microscopia de luz. cortes ultrafinos (60 nm) foram coradas com acetato de uranilo e citrato de chumbo. Além disso, um pequeno pedaço de cérebro (5 mm3) foi homogeneizado em tampão. A suspensão foi em seguida clarificados por centrifugação de baixa velocidade, e o sobrenadante obtido foi ultracentrifugado directamente sobre uma grelha de microscópio electrónico com o uso de um Airfuge (Beckman Coulter). coloração negativa foi realizada com ácido fosfotúngstico a 1%. Imagiologia do cérebro e cortes ultrafinos homogenato foi realizada com a utilização de um 120-kV JEM-1400Plus microscópio electrónico de transmissão (JEOL).

imunofluorescência indireta

secções embebidas em parafina de tecido cerebral fetal e o tecido cerebral de um homem autopsiados como um controlo negativo foram incubadas com o soro obtido a partir da mãe do feto (diluição 1:10), seguido de IgG anti-humanos de anticorpos marcados com isotiocianato de fluoresceína (FITC ) (diluição 1:50). Além disso, o tecido de cérebro fetal foi incubado com um soro obtido a partir de um dador de sangue saudável, bem como com apenas anticorpos IgG anti-humanos marcados com FITC.

microbiológica Investigation

O ARN foi extraído a partir de 10 mg de a placenta, pulmões, coração, pele, baço, timo, fígado, rins, e no córtex cerebral com o uso de um kit de purificação de RNA TRIzol Plus (Thermo Fisher Scientific). Em tempo real de RT-PCR para a detecção de ARN ZIKV (NS5) e de um passo de RT-PCR para a detecção da região de codificação da proteína de envelope (360 pb) foram realizadas como descrito anteriormente. 7,8 Além disso, NEXT- geração sequenciação foi realizada em amostras de tecido de cérebro fetal com o uso de iões Torrent (Thermo Fisher Scientific) e o software Geneious, versão 9.0.6. Lê de ambas as corridas foram combinados e mapeada para a sequência de referência (ZIKV MR766; LC002520) com a utilização de medidas padrão. Para a análise filogenética, foram utilizadas seqüências ZIKV completa do genoma, e alinhamentos múltiplos de sequências (ClustalW) foram realizadas. Uma árvore filogenética de neighbor-joining (GTR + L + I modelo) foi construído, com o uso do sistema de software MEGA6, 9 para mostrar as relações filogenéticas. A sequência de nucleótidos de ZIKV que foi obtida neste estudo foi depositado em GenBank com o número de acesso KU527068. Uma descrição detalhada dos métodos moleculares é fornecido no Apêndice Suplementar , disponível com o texto integral do presente artigo no NEJM.org. Os resultados da análise sorológica abrangente de soro materno e uma descrição dos processos de diagnóstico diferencial moleculares utilizados com amostras de tecidos fetais são fornecidos nas Tabelas S1 e S2 no Apêndice suplementar . Todos os autores atestar a integridade e precisão dos dados e análises apresentadas.

RESULTADOS

Os resultados da autópsia e neuropatológicos

O peso corporal fetal foi 1470 g (percentil 5), o comprimento 42 cm (percentil 10), e as perímetro cefálico 26 cm (1º percentuais). A única anomalia externa que foi notado foi microcefalia. A placenta pesava 200 g, resultando numa proporção em peso da placenta fetal de 0,136 (<percentil 3). O exame macroscópico do SNC revelou microcefalia com um peso todo o cérebro de 84 g (4 SD abaixo da média), fissuras silvianas amplamente abertas, e uma pequena haste cerebelo e cérebro. Foram observadas agiria quase completa e hidrocefalia interna dos ventrículos laterais.Houve numerosas calcificações de tamanho variável no córtex e substância branca subcortical nos lobos frontal, parietal e occipital. Os núcleos subcorticais foram muito bem desenvolvido ( Figura 1C e 1D ). Apesar de alguns autólise, o exame microscópico revelou citoarquitetura apropriada do cérebro do feto. As características histopatológicas mais proeminentes eram coleções multifocais de filamentosa, granular, e calcificações em forma de neurônios no córtex e substância branca subcortical com o envolvimento focal de toda a fita cortical, ocasionalmente associado com deslocamento cortical ( Figura 2A e 2B FIGURA 2Análise microscópica do tecido cerebral.).Astrogliosis difusa esteve presente com explosão astrocitário focal para o espaço subaracnóide, principalmente na convexidade dos hemisférios cerebrais ( Figura 2C ). Células microgliais activadas e alguns macrófagos que expressam HLA-DR estavam presentes durante a maior parte da cinza cerebral e substância branca ( Figura 2D ).Dispersas infiltrados perivasculares leves compostas por células T e algumas células B estavam presentes na matéria branca subcortical (Fig. S1 no Apêndice Complementar ). O cerebelo, tronco cerebral e medula espinhal mostrou nem inflamação nem calcificações distróficas. O tronco cerebral ea medula espinhal mostrou degeneração Walleriana das vias longa descendente, especialmente o trato corticospinal lateral, enquanto que ascensão colunas dorsais foram bem preservado ( Figura 2E ).Imunofluorescência indireta revelou reação intracitoplasmática granular em estruturas neuronais destruídas, que apontavam para uma possível localização do vírus em neurônios ( Figura 2F , e Fig. S1 no Apêndice Suplementar ). O exame histológico da placenta confirmou calcificações focais nos vilos e decídua, mas nenhuma inflamação foi encontrado. Não houve alterações patológicas relevantes em outros órgãos fetais ou no cordão umbilical ou membranas fetais. cariotipagem fetal com o uso da tecnologia de microarray mostrou um perfil normal 46XY (macho).

Microscopio eletronico

Embora a análise das secções ultrafinas do cérebro mostrou pouco preservada tecido cerebral com células rompidas e lisadas, aglomerados de partículas semelhantes a vírus densas de aproximadamente 50 nm de tamanho foram encontrados em vesículas citoplasmáticas danificados.Grupos de estruturas envelopados com um interior luminoso, foram também detectados. Na periferia de tais grupos, os restos das membranas pode ser visto. Coloração negativa de cérebro homogeneizado revelou partículas de vírus esférico de 42-54 nm, com características morfológicas consistentes com vírus da família Flaviviridae ( Figura 3A FIGURA 3Microscopia Eletrônica de cortes ultrafinos de Fetal Cérebro e coloração de uma partícula Flavivirus-like.).

microbiológica Investigation

Os resultados positivos foram obtidos para ZIKV no ensaio de RT-PCR, apenas na amostra de cérebro fetal, onde 6,5 × 10 7 virais cópias de RNA por miligrama de tecido foram detectados. Além disso, todas as amostras de autópsia foram testados em ensaio de PCR e foram encontrados para ser negativos para outros flavivírus (o vírus da dengue, vírus da febre amarela, vírus do Nilo Ocidental, e vírus da encefalite transmitida por carrapatos), juntamente com o vírus chikungunya, coriomeningite linfocítica, citomegalovírus, vírus da rubéola, vírus da varicela-zoster, vírus herpes simplex, o parvovírus B19, enterovírus, e Toxoplasma gondii (Tabela S2 noApêndice complementar ).

Uma sequência ZIKV genoma completo (10,808 nucelotides) foi recuperada a partir de tecido cerebral. A análise filogenética mostrou a maior identidade (99,7%) com a cepa ZIKV isolado de um paciente de Polinésia Francesa em 2013 (KJ776791) e ZIKV detectado em São Paulo, Brasil, em 2015 (KU321639), seguido por uma cepa isolada no Camboja em 2010 (JN860885, com a identidade de 98,3%) e com uma cepa do surto em Micronésia em 2007 (EU545988, com a identidade de 98%) ( Figura 4 FIGURA 4Análise filogenética do genoma completo do vírus Zika.).No poliproteína ZIKV, 23 polimorfismos foram detectados em comparação com a estirpe de Micronésia e 5 polimorfismos em comparação com o isolado de Polinésia;três mudanças de aminoácidos foram encontrados na região NS1 (K940E, T1027A, e M1143V), uma na região de NS4B (T2509I), e um na região metiltransferase FtsJ-like (M2634V).

DISCUSSÃO

Este caso mostra lesão grave do cérebro fetal associada à infecção ZIKV com a transmissão vertical. Recentemente, ZIKV foi encontrado no líquido amniótico de dois fetos que foram encontrados para ter microcefalia, que era consistente com a transmissão intra-uterina do vírus. 10 casos descritos são semelhantes ao caso aqui apresentado e foram caracterizados por CNS severamente afetada e retardo do crescimento intra-uterino bruta . Calcificações na placenta e uma proporção em peso baixa placentário-fetal, 11 , que foi observado neste caso, indicam possíveis danos para a placenta pelo vírus. Entre os poucos relatos de efeitos teratogênicos do flavivírus, os investigadores descreveram o cérebro e os olhos como os principais alvos. 12,13 Sem a presença de vírus e não há alterações patológicas foram detectados em quaisquer outros órgãos fetais para além do cérebro, o que sugere uma forte neurotropismo de o vírus.

A localização do sinal de imunofluorescência e a aparência morfológica das calcificações, que se assemelhava destruídas estruturas neuronais, indicam uma possível localização do vírus em neurónios. A consequente dano pode causar o desenvolvimento do córtex cerebral preso na idade embrionária de aproximadamente 20 semanas. 14 O mecanismo envolvido na neurotropismo de ZIKV não está clara. A associação entre a infecção ZIKV e anomalias fetais cerebrais também foi observado por dados da microscopia eletrônica que eram consistentes com detecção ZIKV no cérebro fetal. partículas densas consistentes com ZIKV foram vistos no retículo endoplasmático danificado. Grupos de estruturas com envelope com um interior luminoso, assemelhando-se os restos de complexos de replicação que são característicos de flavivírus 15,16 indicam a replicação viral no cérebro. As conclusões sobre microscopia eletrônica sugerem uma possível persistência de ZIKV no cérebro fetal, possivelmente por causa do meio imunologicamente seguro para o vírus. O número de cópias virais que foram detectados em cérebro fetal foram substancialmente superiores aos relatados no soro obtido a partir de doentes infectados com ZIKV adulto 17 , mas semelhantes aos relatados em amostras de sémen. 18

A sequência completa do genoma de ZIKV que foi recuperado neste estudo é consistente com a observação de que a presente estirpe no Brasil surgiu a partir da estirpe asiática. 19 A presença de duas substituições de aminoácidos importantes posicionado em proteínas não estruturais NS1 e NS4B, provavelmente, representa um acidental evento ou indica um processo de uma eventual adaptação do vírus a um novo ambiente. Mais pesquisas são necessárias para compreender melhor as potenciais implicações destas observações. É provável que a rápida disseminação da ZIKV todo o mundo será um forte impulso para a investigação em colaboração sobre as propriedades biológicas do vírus, particularmente desde que o risco de neurotrópico e infecções por vírus teratogênicos coloca uma carga emocional e económico para a sociedade.

Formas de divulgação previstas pelos autores estão disponíveis com o texto integral do presente artigo no NEJM.org.

Este artigo foi publicado em 10 de Fevereiro, 2016, em NEJM.org.

Agradecemos o paciente, neste caso, pela sua disponibilidade para fornecer dados médicos e imunológica detalhada;Miha Juvan para processamento de fotografias do cérebro; Peter Štrafela por sua ajuda com as análises neuropatológicas; Martin Sagadin, Tina Uršič, Nataša Toplak, Simon Koren e Andrej Steyer por sua assistência na detecção de vírus, seqüenciamento e análise de dados sequenciamento de última geração; Mateja Jelovsek por sua assistência em investigações sorológicos abrangentes e Luca Lovrečič e Marija Volk por sua assistência na cariotipagem molecular com testes de microarray.

INFORMAÇÕES FONTE

Do Instituto de Patologia da Faculdade de Medicina (J. Mlakar, M. Popović, J. Mraz, AV, JP), e do Instituto de Microbiologia e Imunologia da Faculdade de Medicina (M. Korva, MP-P., M. Kolenc, KRR, M. Petrovec, TAZ), Universidade de Ljubljana, e do Departamento de Perinatologia, Divisão de Ginecologia e Obstetrícia (NT, VFV), e do Instituto de Radiologia (TVV), University Medical Center Ljubljana - tudo em Ljubljana, Eslovénia.

Solicitações de endereço reimpressão ao Dr. Avšič Zupanc do Instituto de Microbiologia e Imunologia da Faculdade de Medicina da Universidade de Ljubljana, Zaloška 4, Lubliana 1000, Eslovênia, ou pelo tatjana.avsic@mf.uni-lj.si .